固態(tài)光源點(diǎn)亮熒光原位雜交技術(shù)---提升生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷新選擇

什么是FISH？

當(dāng)然這里的FISH并非水里游的魚(yú)類(lèi)，而是熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，簡(jiǎn)稱(chēng)FISH），這是一種基于雙鏈核酸互補(bǔ)堿基配對(duì)的細(xì)胞或者組織中特定核酸序列（DNA或者RNA）檢測(cè)的技術(shù)。就如同釣魚(yú)一般，根據(jù)堿基互補(bǔ)原則，當(dāng)使用已知標(biāo)記單鏈核酸為探針（餌），如果與樣品中的未知單鏈核酸（魚(yú)）發(fā)生了特異性結(jié)合，形成可被檢測(cè)的雜交雙鏈核酸，并對(duì)該特定核酸順序進(jìn)行精確定量定位。

F:熒光（Flourescence）顯微鏡用于對(duì)靶核酸序列位置進(jìn)行成像。該技術(shù)的其他變體也使用顯色原位雜交（CISH）。

IS:靶核酸序列在其所在的細(xì)胞或組織的空間環(huán)境中原位（in suit）檢測(cè)。FISH提供有關(guān)位置的信息，以及靶核酸序列的同一性和多樣性。

H:識(shí)別特定核酸序列的基本原理是通過(guò)互補(bǔ)堿基配對(duì)將單鏈探針序列與單鏈靶序列雜交（hybridization）（圖1）。

圖1.熒光原位雜交(FISH)示意圖。用于臨床細(xì)胞遺傳學(xué)的DNA探針通常長(zhǎng)度約為100,000個(gè)堿基(100 kb)，每100個(gè)堿基約有5個(gè)染料。

FISH在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用

FISH使科學(xué)家和臨床醫(yī)生能夠繪制基因圖譜，研究染色體組織，診斷和評(píng)估遺傳疾病，并表征染色體異常。一個(gè)感興趣的領(lǐng)域是染色體末端端粒區(qū)域的分析。端粒通過(guò)保護(hù)染色體末端不降解，在細(xì)胞分裂過(guò)程中保存遺傳信息方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。端粒異常（如重復(fù)或缺失）可以通過(guò)使用FISH的篩選輕松識(shí)別，其中端粒用熒光探針序列標(biāo)記（圖2）（1）。鑒于端粒不規(guī)則性可導(dǎo)致各種疾病，例如與年齡相關(guān)的綜合征或癌癥，端粒畸變的鑒定可以為疾病機(jī)制提供新的見(jiàn)解，并指導(dǎo)靶向治療的開(kāi)發(fā)（2）。

（1）Telomere analysis using 3D fluorescence microscopy suggests mammalian telomere clustering in hTERT-immortalized Hs68 fibroblasts.

（2）Molecular cytogenetic analysis of telomere rearrangements.

雖然FISH是生物醫(yī)學(xué)研究中使用的強(qiáng)大細(xì)胞遺傳學(xué)工具，但細(xì)胞內(nèi)特定核酸序列的可視化在很大程度上依賴(lài)于照明的質(zhì)量和功能。通過(guò)在面對(duì)嚴(yán)苛的工作負(fù)載時(shí)能保持始終如一的性能，Lumencor 光引擎使臨床醫(yī)生、研究人員和設(shè)備制造商能夠?qū)崿F(xiàn)更好的基因組和分子診斷。

圖2.人類(lèi)細(xì)胞的染色體組型，該細(xì)胞在分裂中期含有46條染色體。DNA以DAPI染色（藍(lán)）并通過(guò)使用PNA-TeIC探針(綠)以FISH檢測(cè)端粒。由于每條染色體含有兩個(gè)染色單體，并且每個(gè)染色單體中都包含兩個(gè)端粒，因此共觀察到184個(gè)雜交探針。（圖像比例尺=5μm）

*圖像是使用Nikon Ti Eclipse寬場(chǎng)系統(tǒng)和Lumencor Light Engine獲取的，Lumencor系列固態(tài)光源可以適配各類(lèi)主流顯微鏡品牌。

FISH光源的五大照明要求，固態(tài)光源來(lái)滿足

1.支持多重檢測(cè)的光譜范圍

Lumencor的SOLA FISH光引擎是為FISH應(yīng)用量身定做的型號(hào)，其輸出的光譜允許使用具有五個(gè)或者更多激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)范圍的熒光標(biāo)記來(lái)同時(shí)檢測(cè)相應(yīng)數(shù)量的不同DNA靶序列。遺傳性疾病通常是多因素的，因此這種光譜的多樣性是一種普遍的要求。例如，特異性分析物試劑盒（analyte specific reagent kits) 如Vysis MultiVysion PB 多色FISH探針試劑盒 (Abbott Molecular) 可以用于同時(shí)檢測(cè)13、16、18、21和22號(hào)染色體的拷貝數(shù)，這對(duì)于檢測(cè)對(duì)胎兒健康和生存能力有重大影響的染色體異常至關(guān)重要。固態(tài)光源（如SOLA FISH）有助于設(shè)計(jì)光譜輸出，以盡可能滿足于此類(lèi)細(xì)胞遺傳性測(cè)試的要求（圖3）。

圖3.SOLA FISH光引擎輸出光譜和chroma激發(fā)濾光片，用于SpectrumBlue、SpectrumAqua、SpectrumGreen、SpectrumGold 和 SpectrumRed。這些熒光團(tuán)被摻入用于確定染色體 13、16、18、21 和 22 的拷貝數(shù)的 FISH 探針中，這在多重檢測(cè)允許同時(shí)檢測(cè)。

2.線性光強(qiáng)調(diào)制

使用SOLA FISH等固態(tài)光源時(shí)，輸出光可通過(guò)20倍動(dòng)態(tài)范圍的線性控制響應(yīng)進(jìn)行電子衰減。當(dāng)需要調(diào)整照明強(qiáng)度以適應(yīng)樣本之間的差異時(shí)，通過(guò)電子軟件控制即可完成，這是可預(yù)測(cè)和可重復(fù)的方式，而無(wú)需插入中性密度濾光片等附加光學(xué)元件。此外，使用電子衰減時(shí)輸出光譜也不會(huì)受影響。

3.設(shè)備間的一致性

當(dāng)購(gòu)買(mǎi)用于多個(gè)細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)設(shè)備的光源組時(shí)，所有光源的性能和操作特性的一致性至關(guān)重要。低方差意味著內(nèi)部數(shù)據(jù)一致和操作效率。固態(tài)光引擎（如 SOLA FISH）顯然滿足這些要求，多個(gè)設(shè)備間光譜輸出相當(dāng)一致（圖 4）。

圖4.隨機(jī)選擇的28臺(tái)Lumencor SOLA光引擎的光譜分布和光功率。2%的方差系數(shù)表明光引擎之間的一致性和相同的有效性能。

4.使用壽命長(zhǎng)、運(yùn)行可靠

固態(tài)光源無(wú)需維護(hù)，與每年需要數(shù)千美元更換燈泡的汞燈以及金屬鹵化物燈相比，其耗材費(fèi)用極低。SOLA FISH的成本可以在其10-15年的工作壽命內(nèi)的2-3年內(nèi)，通過(guò)耗材支出的節(jié)省得到回收。

5.內(nèi)置計(jì)量和自動(dòng)化兼容性

SOLA FISH 等現(xiàn)代固態(tài)光源集成了板載微處理器，除了控制操作外，還可以監(jiān)控系統(tǒng)性能。累計(jì)光輸出時(shí)長(zhǎng)、功耗和內(nèi)部工作溫度等數(shù)據(jù)可用于上傳到實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng) （LIMS） 并支持監(jiān)管合規(guī)性驗(yàn)證。此外，多個(gè)光引擎可以通過(guò)以太網(wǎng)連接，允許從單個(gè)中心點(diǎn)進(jìn)行操作控制。

總的來(lái)說(shuō)，Lumencor的SOLA FISH光引擎結(jié)合了厲害的技術(shù)、可靠性和成本效益，使其成為各種研究和臨床環(huán)境中FISH應(yīng)用的選擇。

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